南方医科大学，较新Science大子刊，治疗新靶点！

深度解析医学证据，DeepEvidence为你支撑决策

非小细胞肺癌可发生柔脑膜转移，该并发症发生率约5‑10%，患者预后极差，确诊后生存期仅2‑5个月，目前临床治疗手段十分有限，很大程度上是因为介导柔脑膜转移进展的关键分子调控机制尚不明确。脑脊液微环境的营养构成和颅外组织差异巨大，肿瘤细胞必须完成代谢重编程才能在脑脊液中存活定植，已有研究发现部分营养摄取相关分子参与中枢转移，但脂肪酸摄取如何推动柔脑膜转移尚未阐明。另外肿瘤细胞可发生神经内分泌样转化，部分脑转移肿瘤会获得神经元相关表型以适应中枢微环境，但神经内分泌分化在肺癌柔脑膜转移中的作用还不清楚。FUS是一种RNA结合蛋白，既往研究主要聚焦其在神经退行性疾病中的功能，它在肿瘤尤其是肺癌柔脑膜转移中的作用未见报道。

南方医科大学吴一龙院士、黎扬斯教授、中国科学院广州生物医药与健康研究院李鹏研究员等人开展体内全基因组CRISPR敲除筛选，锁定FUS作为柔脑膜转移的抑制分子，进一步探究FUS缺失如何通过下游分子改变，调控肿瘤细胞代谢、内皮屏障侵袭、神经内分泌样表型，同时结合临床样本评估相关分子的临床意义，寻找柔脑膜转移潜在的治疗靶点与预后标志物。相关内容以“FUS inactivation promotes leptomeningeal metastasis of lung cancer through the up- regulation of CD36”为题发表在《Science Translational Medicine》上。

【主要内容】

图1 体内全基因组CRISPR筛选鉴定FUS为柔脑膜转移抑制基因

该图展示体内全基因组CRISPRCas9筛选的整体实验流程，对多候选基因敲除后的小鼠各器官转移发生率、生存曲线进行统计分析，筛选得到FUS是可显著促进柔脑膜转移的基因，通过生物发光成像、脑组织H&E及免疫组化验证FUS敲除能够提升肿瘤柔脑膜转移发生概率、缩短小鼠生存期，同时利用临床NSCLC样本证实肿瘤FUS低表达的患者更快进展至柔脑膜转移，且发生柔脑膜转移后总生存更差，原发灶与配对柔脑膜转移灶的染色结果也印证转移病灶FUS蛋白表达下调。

图2 FUS通过降解PPARA的mRNA抑制CD36表达

该图对FUS敲除与柔脑膜转移细胞开展转录组分析，GSEA显示脂肪酸转运代谢通路显著富集，结合临床脑脊液肿瘤细胞样本证实FUS与CD36表达呈负相关，细胞层面敲除FUS上调CD36、过表达FUS下调CD36，借助PARCLIPseq、RNA免疫沉淀证明FUS直接结合PPARA的mRNA，放线菌素D实验证明FUS促使PPARA mRNA发生降解，PPARα拮抗剂可以逆转FUS缺失带来的CD36上调。

图3 FUS缺失依赖CD36上调介导非小细胞肺癌柔脑膜转移

该图通过Transwell跨内皮迁移实验发现，同时敲除FUS与CD36可以有效缓解逆转FUS缺失带来的跨内皮迁移能力提升，体内动物模型显示FUS/CD36双敲除能够显著降低柔脑膜转移发生率、延长小鼠生存；在柔脑膜转移潜能细胞系中敲除CD36会抑制迁移与柔脑膜转移，而过表达CD36则会增强肿瘤细胞跨内皮迁移，促进小鼠柔脑膜转移、缩短生存，一系列基因回补与双基因敲除体内外实验，证明CD36是FUS缺失驱动柔脑膜转移的必需下游效应分子。

图4 CD36介导脂肪酸摄入上调MMP2破坏内皮屏障促进柔脑膜转移

该图对过表达CD36且棕榈酸处理的细胞进行转录组分析，发现基质金属蛋白酶通路显著激活，棕榈酸处理可以提升MMP2的蛋白表达与分泌，CD36抑制剂SSO能够阻断该效应；MMP2敲除可以消除CD36过表达带来的跨内皮迁移能力提升，体内实验证实MMP2缺失能够削弱CD36介导的柔脑膜转移，改善小鼠生存。

图5 FUS缺失诱导CD36依赖的神经内分泌样分化表型

该图在脑脊液补充的体外培养条件下观察到，FUS敲除细胞出现神经突样突起，增殖能力增强，而同时敲除CD36可消除该神经内分泌样形态与增殖优势；β受体阻滞剂普萘洛尔能够抑制神经内分泌分化标志物表达，体外抑制肿瘤细胞在脑脊液环境的增殖，鞘内注射普萘洛尔的动物模型可抑制柔脑膜转移负荷、延长小鼠存活。

图6 脂肪酸摄取提升乙酰CoA与H3K27ac修饰，诱导神经内分泌分化及MMP2表达

该图借助线粒体压力测试证明FUS缺失细胞CD36依赖氧化磷酸化水平升高，线粒体形态发生融合改变；代谢组检测发现FUS敲除后细胞乙酰CoA水平上升，该改变依赖CD36；蛋白检测显示组蛋白H3K27ac乙酰化修饰水平升高，CUT&Tag实验进一步证实脂肪酸处理会提升神经内分泌分化相关基因MAP2、ENO2、SYP以及MMP2基因位点的H3K27ac修饰，从代谢表观遗传层面解释脂肪酸如何驱动促转移基因转录激活。

图7 药物抑制CD36可有效抑制非小细胞肺癌柔脑膜转移

该图体外Transwell实验验证CD36抑制剂SSO抑制肿瘤细胞跨内皮迁移，利用细胞来源移植模型、柔脑膜转移PDX病人来源移植模型，分别使用口服SSO、鞘内注射抗CD36中和抗体干预，两种靶向CD36的药物处理均可降低小鼠柔脑膜转移的发生，减轻颅内肿瘤负荷，显著延长荷瘤小鼠生存期，证明药理靶向CD36在多种临床前模型中对柔脑膜转移具备治疗效果。

图8 CD36可作为柔脑膜转移的临床生物标志物并反映治疗响应

该图对临床配对的原发肺癌与柔脑膜转移病灶组织染色，显示转移灶CD36蛋白表达更高；临床队列的转录组数据证明发生柔脑膜转移的患者原发肿瘤CD36 mRNA表达更高；流式检测患者脑脊液中EpCAM⁺肿瘤细胞，柔脑膜转移患者脑脊液肿瘤细胞CD36阳性比例更高，脑脊液肿瘤细胞CD36高表达对应患者更差的预后；结合多位患者随访的MRI影像和脑脊液流式检测结果，观察到治疗响应的患者脑脊液CD36阳性肿瘤细胞数量下降。

【全文总结】

该研究针对非小细胞肺癌柔脑膜转移预后差、机制不明的问题，通过体内CRISPR筛选发现RNA结合蛋白FUS是柔脑膜转移抑制基因。FUS可结合并降解PPARA mRNA，抑制脂肪酸转运蛋白CD36；FUS失活后CD36上调，肿瘤细胞脂肪酸摄取增加，乙酰‑CoA升高，提升H3K27ac表观修饰，一方面上调MMP2破坏脑内皮屏障，促进肿瘤细胞浸润，另一方面激活神经内分泌分化程序，让癌细胞适应脑脊液微环境，推动柔脑膜转移。